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                              轻松搞定microRNA靶基因验证

                              当前,microRNA对靶基因的功能研究十分热门。利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不可或缺的实验技术。中洪博元可为您提供microRNA报告基因载体构建服务,并可进一步为您提供荧光素酶报告基因检测实验服务。


                              您只需要提供目的microRNA靶位点序列,我们专业的技术服务人员就可替您完成载体构建,为您节省大量的时间和精力。(服务内容包括:靶位点序列合成、载体构建、细胞转染、荧光信号检测和结果分析。


                              下图为双荧光素酶报告基因载体表达框架示意图,具有多克隆位点,方便插入目的靶点序列。pmirGLO载体包含萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶报告基因。


                              萤火虫荧光素酶报告基因为主要报告基因。若目的基因表达被抑制,则使萤火虫荧光素酶转录过程受阻,抑制萤火虫荧光素酶蛋白翻译,萤火虫荧光值下降,而作为标准化内参照的海肾荧光素酶的表达不受影响,此时萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性值下降,从而可以确定miRNA与靶基因是否具有直接调控作用。



                              图片来源:中洪博元医学实验帮


                              构建双荧光素酶报告基因实验流程:


                              构建含靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体、microRNA mimics或 microRNA negativecontrol共转染293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,进一步验确定目的 microRNA的靶基因。


                              1. microRNA靶点的预测


                              利用Targetscan,miRDB,PicTar软件预测靶基因3’UTR与microRNA的结合位点。


                              2. 构建含靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体


                              根据软件预测的靶基因3’UTR与microRNA的结合位点,设计引物PCR扩增靶基因3’UTR序列,或直接进行基因合成,再插入到双荧光素酶报告基因载体上。


                              3.microRNA mimics和 microRNA negativecontrol的合成


                                    合成相应的microRNA mimics和 microRNA negativecontrol.


                                    4.细胞转染准备


                                    将靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体和microRNA mimics或microRNA negativecontrol共转染293T或Hela细胞。


                                    5.荧光素酶检测


                                    共转染细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,确定目的microRNA的靶基因。


                              整理分析数据,得出结论:


                                    提供有含靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体甘油保存菌株一支,microRNA mimics和 microRNA negativecontrol各一只。


                              附相应的载体的说明书以及实验报告:


                              包括载体构建过程,载体鉴定记录,测序报告,细胞转染,荧光检测,图表输出和结果分析。

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