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                              手把手教你近端肾小管上皮细胞原代分离

                              实验操作流程:


                                     1、取双肾,置于冷的PBS中;


                                     2、去除肾蒂和包膜,在体式显微镜下切除肾皮质;


                                     3、将肾皮质剪碎,移入EP管中,PBS洗3次;


                                     4、清洗完毕,沉淀用1g/LⅠ型胶原酶,37℃,30min消化;


                                     5、加入3倍体积的完全培养基终止消化;


                                     6、将细胞悬液过80目筛;


                                     7、收集悬液,200目筛、1000rpm.离心5min;


                                     8、沉淀用45%percoll分离液制备25ml悬液;


                                     9、悬液置于5ml 100%percoll上,14000rpm,4℃,离心25min.;


                                     10、分层,选择倒数第二层细胞悬液;



                                     11、得到近端肾小管上皮细胞,用DF12+10%FBS+双抗铺板


                              注意事项:


                                     鼠龄要选小一些的,我们一般选2周内的,这样细胞生长活性更好



                              Q:为什么我取得原代肿瘤组织,分离的却不是肿瘤细胞?


                              A:取材时,我们要熟悉所需组织的类型和部位特征,选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。


                              Q:若是细胞中混成纤维细胞,如何去除?


                              A:成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快,可利用反复贴壁法使二者分离,进而达到清除成纤维细胞的目的。


                              Q:为什么离心后,没有细胞分离出来?


                              A:需要考虑消化酶的因素,由于肿瘤组织较致密,胰酶无法消化,一般选用胶原酶,如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法,如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别:



                              注:胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,根据分离的组织类型需选择合适的胶原酶类型。



                              Q:消化时间如何确定?


                              A:具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。


                              Q:消化之前为什么用EDTA?


                              A:EDTA是一种非酶消化物,又称螯合剂,对一些组织,尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后,形成的机械力可使细胞分散。




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